SARS нерукотворный

    Эту статью могут комментировать только участники сообщества.
    Вы можете вступить в сообщество одним кликом по кнопке справа.
    Екатерина Иванова перепечаталa из habr.com
    0 оценок, 41 просмотр Обсудить (2)

    Не, ну какая рукотворность? Что за бред? Думал я, когда впервые услышал гипотезу о том, что Ковид-19 вызван то ли лабораторной утечкой, то ли вообще целенаправленной биоатакой. И каждый раз просто отмахивался от этих домыслов, когда они в очередной раз доплывали до меня в бурном потоке коронавирусного инфошума. Ну подумаешь, есть в Ухане институт вирусологии, мало ли.

    В какой-то момент отмахиваться уже пришлось аргументированно, потому что сторонники рукотворности начали обосновывать свои тезисы о возможной искусственной природе вируса доводами из молекулярной биологии, и тут уже хотелось в пух и прах разбить их конспирологию холодными научными фактами. Уж если не как авторы статьи в Nature (казалось мне), то хотя бы как уважаемый мной Панчин.
    И вот тут, в погоне за доводами против рукотворности вируса, меня и заразил вирус сомнений. В чём, собственно, причина сомнений? В том, что чем глубже погружаешься в деятельность коронавирусологов за последние 15–20 лет, тем лучше понимаешь, что создание ровно таких химер как CoV2 у них было обыденным делом. А CoV2 — это очевидная химера, основанная на летучемышином штамме RaTG13, у которого в шиповидном белке место связывания с рецептором (RBM) заменено с летучемышиного на панголиний, и вдобавок врезан особый участок из 4-х аминокислот, создавший furin cleavage site, который, как ранее выяснили вирусологи, значительно расширяет «репертуар» вируса в плане того, в чьи клетки он может проникать. Скорее всего, именно благодаря этому новому фуриновому сайту, новый мутант и сумел перескочить с исходных носителей на людей.
    С учётом тех высот, которых сегодня достигла генная инженерия, синтетически собрать CoV2 по вышеописанной методике не составило бы труда даже начинающему специалисту. Ведь вирусологи, включая руководителя коронавирусного направления в Уханьском институте вирусологии Ши Чжэнли, такими вещами уже неоднократно занимались — как заменой RBM у одного вида вируса на RBM из другого вот работа группы Ши Чжэнли от 2007 года), так и добавлением нового фуринового сайта, способного дать специфичному к одному виду животных коронавирусу возможность начать использовать рецептор ACE2 других видов. ак достоверной/полезной, так и наоборот.

    Ши Чжэнли в своей лаборатории в Уханьском институте вирусологии

    Но прежде чем разводить тут конспирологию, давайте сначала окунёмся в биологию.

    Биология

    Итак, начнём от печки. Что за фуриновый сайт, что за RBM, что вообще за шиповидный белок? На самом деле, если продраться сквозь дебри терминологии, то концептуально всё просто. Вот, например, шиповидный белок — это та самая торчащая из вирусной частицы штука (S protein), за которую эти вирусы и “короновали”:


    Именно с помощью этих белков вирион цепляется за рецептор клетки-жертвы (ACE2 в нашем случае), чтобы затем проникнуть внутрь. Поэтому можно сказать, что это самая важная часть вируса, ведь именно она определяет каких животных тот может поражать, а каких нет — ACE2 рецепторы у разных видов немного структурно отличаются. При этом из всего огромного по вирусным меркам 30-килобазного генома, ген этого белка составляет лишь 12–13%, то есть около 1300 аминокислот. Вот так структурирован шиповидный белок у CoV2 и его близких родственников:


    Как видно из рисунка выше, S белок состоит из двух субъединиц: S1 и S2. Именно S1 взаимодействует с рецептором ACE2, и то место, которым он это делает, называется Receptor Binding Domain (RBD), а область непосредственного контакта, святая святых, называется Receptor Binding Motif (RBM). Вот красивая иллюстрация из не менее красивой работы:

    Общая структура RBD CoV2, связанного с ACE2.
    (а) Общая топология мономера шиповидного белка 2019-nCov. NTD, N-терминальный домен. RBD, рецептор-связывающий домен. RBM, рецептор-связывающий мотив. SD1, поддомен 1. SD2, поддомен 2. FP, пептид слияния. HR1, гептадный повтор 1. HR2, гептадный повтор 2. TM, трансмембранная область. IC, внутриклеточный домен.
    (б) Последовательность и вторичные структуры RBD 2019-nCov. RBM окрашен в красный цвет.
    (с) Общая структура RBD 2019-nCov, связанного с ACE2. ACE2 окрашен в зеленый цвет. Ядро RBD 2019-nCoV окрашено в голубой цвет, а RBM — в красный. Дисульфидные связи в RBD 2019-nCov показаны в виде линии и обозначены желтыми стрелками. N-концевая спираль ACE2, ответственная за связывание, помечена.

    Исходный текст


    Так вот. Когда геном CoV2 только расшифровали, то сначала не было известно каких-то прям близкородственных ему штаммов. Но уже 23 января 2020 года Ши Чжэнли выпустила работу, в которой объявила, что CoV2 на 96% совпадает со штаммом RaTG13, который её лаборатория в 2013 году выделила из Юньнаньских летучих мышей. Правда, вне её лаборатории до января 2020 года об этом штамме не было известно никому.

    Было сразу понятно, что RaTG13 — мальчик особенный. Взгляните на график:


    Это график схожести CoV2 с другими известными штаммами. Чем выше кривая, тем выше процент совпадения нуклеотидов. Как видим, в районе гена того самого шиповидного белка (S) только RaTG13 более-менее близок к CoV2, а все остальные штаммы в этом месте уходят в пике — как штаммы вирусов из других летучих мышей, так и первый SARS-CoV (красная кривая). Но тут пока нет ничего подозрительного — мало ли ещё неизвестных науке штаммов таят в себе неизведанные Юньнаньские пещеры? Ну да, не очень понятно как именно вирус оттуда добрался до Уханя, но чего не бывает.

    Панголины

    Далее на сцене появляются панголины: в феврале другая группа китайских учёных обнаружила в своих закромах штамм панголиньего коронавируса, который, хоть в целом и хуже чем RaTG13 был похож на CoV2 (на 90%), в том самом RBM шиповидного белка был почти идентичен — отличался лишь на 1 аминокислоту (см. два верхних сиквенса, точки означают совпадение с первым сиквенсом):


    При этом в первой четверти S белка панголиний штамм на CoV2 не похож, а последовательность после RBM у всех троих штаммов (CoV2, Pangolin, RaTG13) более-менее совпадает. Но вот сам RBM у RaTG13 весьма отличается от CoV2, что видно по крутому провалу зелёного графика RaTG13 по сравнению с красным графиком CoV2 в районе RBM (вертикальная розовая полоса) на следующем графике:


    Эту разницу подтверждает и филогенетический анализ этих трёх областей, выделенных на графике выше — по RBM штамм панголина ближе к CoV2, чем RaTG13, а вот слева и справа от RBM к CoV2 ближе именно RaTG13. То есть налицо явная рекомбинация, о чем упоминают и сами авторы, и некоторые другие работы.

    Кстати, откуда взялись у исследователей эти самые панголины? А вот отсюда:

    Их конфисковала у контрабандистов китайская таможня и передала в реабилитационный центр в Гуандуне, где они скончались при выраженной коронавирусной симптоматике. Это, конечно, не могло не заинтересовать местных вирусологов, которые и выделили у них различный биоматериал:

    Панголины, использованные в исследовании, были конфискованы таможней и Департаментом лесного хозяйства провинции Гуандун в марте-декабре 2019 года. В их число входят четыре китайских панголина (Manis pentadactyla) и 25 малайских панголинов (Manis javanica). Эти животные были отправлены в центр спасения диких животных; в основном они были неактивны и задыхались, и в конечном итоге умерли, несмотря на обширные усилия по их спасению. Образцы тканей были взяты из легких, лимфатических узлов, печени, селезенки, мышц, почек и других тканей у только что умерших панголинов, для гистопатологических и вирусологических исследований.
    Кстати, и не только местных, потому что другие китайские исследователи (гонконгские в данном случае) тоже получали образцы конфискованных панголинов и в феврале 2020 тоже выпустили схожую работу, отметив явные признаки рекомбинации в шиповидном белке CoV2:
    Мы получили образцы замороженных тканей (легких, кишечника, крови), которые были взяты у 18 малайских панголинов (Manis javanica) в течение августа 2017 года — января 2018 года. Эти панголины были получены в ходе операций по борьбе с контрабандой таможней Гуанси. Поразительно, что высокопроизводительное секвенирование их РНК выявило присутствие коронавирусов в шести (два легких, два кишечника, одна смесь легких и кишечника, одна кровь) из 43 образцов.

    Более заметным, однако, было наблюдение предполагаемых сигналов рекомбинации между коронавирусами панголинов, коронавирусами летучих мышей RaTG13 и 2019-CoV2 человека (Рис. 1c, d). В частности, 2019-CoV2 демонстрирует очень высокое сходство последовательностей с коронавирусами панголина из провинции Гуандун в рецептор-связывающем домене (RBD; сходство аминокислот 97,4%; обозначено красной стрелкой на рис. 1c и рис. 2a), хотя в оставшейся части вирусного генома 2019-CoV2 ближе всего к RaTG13. В то же время RaTG13 и 2019-CoV2 имеют только 89,2% сходства аминокислот в RBD. Коронавирусы панголинов из Гуандуна и 2019-CoV2 содержат идентичные аминокислоты в пяти критических остатках RBD, тогда как RaTG13 имеет только одну общую аминокислоту с 2019-CoV2 из этих пяти (остаток 442, нумерация SARS-CoV человека).

    Исходный текст

    Кстати, авторы этой статьи тоже выделили явную филогенетическую мозаичность шиповидного белка CoV2:

    Интересно, что филогенетический анализ только синонимичных сайтов в RBD показал, что филогенетическое положение гуандунского панголина согласуется с положением по остальной части вирусного генома, а именно, что он не является ближайшим родственником 2019-CoV2 (Figure 2b). Следовательно, возможно, что сходство аминокислот в RBD коронавирусов панголина и 2019-CoV2 обусловлено селективно-опосредованной конвергентной эволюцией, а не рекомбинацией, хотя на имеющихся данных трудно выбрать между этими сценариями.

    В переводе с научного, слова авторов означают, что если проанализировать весь RBD трёх штаммов, отбросив явные различия (несинонимичные замены) между ними, которые, в основном, приходятся на RBM (который, напомню, идентичен между CoV2 и Pangolin), и построить филогенетическое древо по синонимичным заменам, то CoV2 таки ближе к RaTG13, а не к панголиньему штамму. Что довольно странно в свете того, что у панголиньего с CoV2 идентичный RBM (то есть отрезок внутри RBD).

    Далее авторы теоретизируют, что это может быть следствием конвергентной эволюции, то есть, иначе говоря, что штаммы CoV2 и панголинов пришли к идентичному RBM каждый своей дорогой, а не через совместную рекомбинацию общих предков. Потому что действительно уж очень странная должна была произойти рекомбинация — как будто кто-то просто взял кусок RBM из панголиньего штамма и заменил им RBM в RaTG13. А это уже смахивает не на эволюцию, а на, прости Дарвин, Intelligent Design.

    Генеалогия коронованных особ

    Для того чтобы получше понять происхождение CoV2, давайте ещё раз взглянем на последовательности шиповидного белка у нашей троицы: CoV2, RaTG13 и панголина — сравним попарную разницу между ними (точками отмечены идентичные аминокислоты, красные буквы показывают разницу, а прочерки обозначают удалённые/добавленные аминокислоты):


    Невооружённым глазом видно, что в первой четверти сиквенса панголиний штамм далёк от CoV2 и RaTG13. Ну а RaTG13, если бы не участок в районе RBM (красный прямоугольник), был бы ооочень близок к CoV2. Но, как я уже говорил, тот самый участок у CoV2 ближе всего к панголиньему штамму.

    Кстати, а что там у других панголиньих штаммов? Давайте посмотрим. Ведь пока что мы анализировали только вирус, выделенный из панголинов, конфискованных таможней в 2019 году. А ещё была партия панголинов, конфискованных в 2017-ом, и у них тоже был выделен похожий штамм. Если сравнить RaTG13 с геномами вирусов из панголинов 2017 и 2019 годов, то тут тоже всё интересно:


    В первой четверти S белка панголиньи штаммы от 2017 года ближе к RaTG13 (и CoV2) чем их панголиний собрат от 2019-го (MP789). При этом, у всех трёх явный недавний общий предок в областях, выделенных зелёными прямоугольниками, и в этих областях RaTG13 и панголин-19 (MP789) к нему ближе, чем панголин-17, так как у него с RaTG13 несколько общих мутаций (обведены красными и синими эллипсами), которых не наблюдается у легенды-17. При этом RBM у всех трёх разный, и разный примерно в одинаковой пропорции, и в схожих местах.

    Возможно, уже после того как предки RaTG13 и MP789 разошлись, у MP789 произошла замена большого участка в первой четверти S белка (которой не произошло у RaTG13 и панголина-17), а остальная часть S белка у всех троих осталась общей. А потом пути генофондов RaTG13 и MP789 сошлись опять и в порыве страсти породили CoV2. Также вполне возможно, что предок RaTG13 является результатом рекомбинации предков панголиньих штаммов.

    Ещё любопытно видеть довольно уникальную одинаковую мутацию (QTQTNS) у RaTG13 и панголина-19 прямо перед тем местом, где у CoV2 находится новый furin cleavage site, возникший из-за врезки 4-х новых аминокислот в этом месте (PRRA). Если посмотреть на нуклеотидную последовательность вокруг этой одинаковой мутации, то видно, что RaTG13 и CoV2 по ней ближе друг к другу, чем к панголину-19, так как успели накопить несколько общих мутаций (выделены синим):


    Кстати, с Orf1ab у CoV2 тоже филогенетическая чехарда: 1a ближе к RaTG13, а вот 1b — к панголину-19:


    То есть получается, что предок CoV2 согрешил с общим предком панголина-19, как минимум, дважды? Впервые — когда он (вместе с общим предком с RaTG13) унаследовал Orf1ab и вторую часть шиповидного белка с QTQTNS мутацией, а вторично — когда приобрёл 1b вместе с RBM, уже отличающимся от RaTG13-шных. Нет, конечно, такое возможно и само по себе не особо примечательно — ведь эти вирусы мутируют и рекомбинируют постоянно. Другой вопрос, где именно летучемышиные и панголиньи вирусы могут друг с другом встречаться для таких оргий — в горных пещерах, “мокрых рынках”, приютах для конфискованных животных, или даже в лабораториях. Но давайте повременим с этими вопросами. Сначала рассмотрим самый бросающийся в глаза аспект нового вируса — врезку из 4-х аминокислот, превратившую его в супер-убийцу.

    Врежу аккуратно, но сильно


    Совершенно невозможно игнорировать эту врезку PRRA между S1 и S2. Как заноза торчит она в геноме нашего нового CoV2. Врезка эта не простая, а золотая. Она создаёт тот самый furin cleavage site, о котором я упомянул в самом начале. Что это за зверь? Попытаюсь вкратце объяснить. Помните структуру нашего шиповидного белка? Вот наглядная диаграмма:


    Белок состоит из двух частей, S1 и S2, из которых S1 отвечает за первичный контакт с рецептором (тот самый Receptor Binding Domain/Motif), а S2 отвечает уже за слияние с клеточной мембраной и проникновение в клетку. Запускает процесс слияния отмеченный жёлтым fusion peptide, но для того чтобы он начал своё грязное дело, кто-то должен разрезать S белок в одном из сайтов, выделенных ромбиками на диаграмме выше. Своих таких “резальщиков” у вируса нет (есть другие, но это к делу не относится), поэтому он полагается на различные протеазы своих жертв, благо таких протеаз, как можно понять по обилию цветов тех самых ромбиков, существует несколько видов. Но не все они равны, и не во всех типах клеток есть нужные вирусу протеазы. А фурин как раз один из самых эффективных, да ещё и обитает он не только на поверхности клеток, но и внутри. Нагляднее всего опасность нового фуринового сайта демонстрирует разница между CoV2 и его “предтечей” SARS-CoV:


    Как видно из диаграммы, в случае CoV2, благодаря фуриновому сайту, разрезать его S белок вне клетки могут не два, а три класса протеаз (три разноцветных пакмэна). Но, быть может, самая важная разница состоит в том, что фурин присутствует и внутри клетки, поэтому он может разрезать S белок сразу после сборки вириона, тем самым повышая способность новых вирионов сливаться с другими клетками — так сказать, не отходя от кассы.

    Кстати, существует вероятность, что именно новый фуриновый сайт играет важную роль в выраженной возрастозависимой морбидности и летальности CoV2:

    По неизвестным причинам, пациенты с гипертонией, диабетом, ишемической болезнью сердца, цереброваскулярными заболеваниями, хронической обструктивной болезнью легких и почечной дисфункцией имеют худшие клинические исходы при инфицировании SARS-CoV-2. Целью данного обзора является обобщение доказательств существования повышенного плазмин(оген)а у пациентов с COVID-19 с этими коморбидными состояниями. Плазмин и другие протеазы могут расщеплять новый фуриновый сайт в шиповидном белке SARS-CoV-2 внеклеточно, что увеличивает его инфекционность и вирулентность.

    Исходный текст

    Ах, да, разрезает фурин белки в строго определённых местах, а именно после последовательности RxxR (то есть Arg-X-X-Arg, где X может быть любой аминокислотой). При этом если на втором или третьем месте тоже аргинин (то есть RRxR или RxRR), то эффективность расщепления этого сайта существенно возрастает.

    Поэтому появление нового furin cleavage site специалистами было замечено сразу. Ещё бы! Ведь такого сайта нет ни у кого из ближайших или даже дальних родственников Cov2 — те коронавирусы, у которых он есть, лишь на 40% близки к Cov2 по геному:

    Было обнаружено, что все шиповидные белки с гомологией белку SARS-CoV-2, превышающей 40%, не имели сайта расщепления фурином (рисунок 1, таблица 1), включая Bat-CoV RaTG13 и SARS-CoV (с идентичностью последовательности как 97,4 % и 78,6% соответственно). Фуриновый сайт «RRAR» в SARS-CoV-2 является уникальным в своем семействе, благодаря уникальной вставке «PRRA». Этот сайт в SARS-CoV-2 вряд ли мог эволюционировать из MERS, HCoV-HKU1 и т.д. Из имеющихся в настоящее время последовательностей в базах данных нам трудно найти источник. Возможно, есть еще много эволюционных промежуточных последовательностей, ожидающих открытия.

    Исходный текст

    Вот наглядная иллюстрация из той же статьи, что и вышеприведённая цитата (розовым отмечены коронавирусы с фуриновым сайтом, на 10 часах приведены 3 разных штамма Cov2):


    Ближайший родственник с фуриновым сайтом — это штамм HKU5, выделенный командой Ши Чжэнли в 2014 году в Гуанчжоу из летучих мышей рода Pipistrellus (добавлен в GenBank в 2018-ом). Но родственник он весьма дальний — их шиповидные белки совпадают лишь на 36%.

    В общем, учёные в замешательстве. Откуда взялась эта вставка из 12 нуклеотидов? Может ли она быть рукотворной? Вполне. Ведь такими вставками вирусологи занимались многократно, причём издавна. Например, американцы вставляли RRSRR в шиповидный белок первого SARS-CoV ещё в 2006-ом:

    Чтобы исследовать, может ли протеолитическое расщепление в месте последовательсти основных аминокислотных остатков способствовать клеточной активности слияния, мы мутировали шиповидный белок SARS-CoV, чтобы создать сайт узнавания фурином (RRSRR) в одном из двух мест.

    Исходный текст


    А японцы вставили такой сайт (RRKR) в белок SARS-CoV в 2008 году, правда немного ниже по течению:


    В том же 2008-ом году их голландские коллеги тоже изучали эти протеазные сайты у SARS-CoV и сравнивали их с мышиным коронавирусом MHV, у которого этот сайт есть (SRRAHR|SV), причём похожий на сайт нашего CoV2 (SPRRAR|SV):


    В 2009 году другая американская группа тоже решила поупражняться над “улучшением” SARS-CoV и, не изменяя американской традиции не мелочиться с аргининами, они вставили RRSRR:

    Чтобы исследовать потенциальное использование SARS-CoV S1-S2 и S2 ‘положений в качестве сайтов для протеолитического расщепления, мы сначала ввели сайты распознавания расщепления фурином в этих местах, сделав следующие мутации 664-SLLRSTSQSI — SLLRRSRRSI-671 (S1-S2) и 792-LKPTKRSF-LKRTKRSF-799 (S2 ‘).

    Исходный текст

    Пекин-2019


    Но самой недавней подобной работой, которую я видел, была работа октября 2019 года учёных из Пекина, где новый фуриновый сайт RRKR вставили не в какой-то псевдовирус, а в самый настоящий куриный коронавирус, infectious bronchitis virus (IBV):


    Кстати, интересно упоминание авторов, что добавление фуринового сайта позволяет вирусу-мутанту поражать нервные клетки. Быть может, именно фуриновый сайт CoV2 является причиной того, что некоторые пациенты с CoV2 демонстрируют неврологическую симптоматику, включая потерю обоняния:

    Мутация сайта S2' шиповидного белка рекомбинантного вируса генотипа QX приводит к более высокой патогенности, выраженным нервным симптомам и нейротропизму по сравнению с цыплятами, инфицированными вурусом дикого типа IBV (WT-IBV). В этом исследовании мы представляем доказательства того, что рекомбинантный IBV с мутантным сайтом S2 (фуриновый сайт-S2) приводит к более высокой смертности. Заражение мутантом IBV вызывает тяжелый энцефалит и разрушает гематоэнцефалический барьер.

    Таким образом, наши результаты демонстрируют, что фуриновый сайт перед FP в шиповидном белке является важным сайтом для CoV, модулирующим проникновение, слияние клеток с вирусом, адаптацию к клетке-хозяину, клеточный тропизм и патогенность, но не антигенность.

    Исходный текст

    При этом у многих коронавирусов фуриновые сайты, конечно же, встречаются в природе, и они весьма разнообразны. Да и появляться они могут и в результате случайных мутаций. Именно это произошло в случае с MERS-ом, о чем в 2015 нам поведал международный коллектив авторов, среди которых были и Ши Чжэнли, и Ральф Барик — две звезды синтетической коронавирусологии. О них мы ещё неоднократно вспомним, а пока пару слов о той статье. Собственно в ней авторы показали две ключевые мутации, которые позволили MERS перескочить с летучих мышей на человека. И одна из этих мутаций привела к возникновению фуринового сайта. Правда это была не врезка новых аминокислот, а мутации ранее существующих (отмеченных красным ниже):


    Авторы не просто показали, а привязали эти мутации обратно к исходному летучемышиному шиповидному белку, создав в нём те же самые мутации (то есть, и фуриновый сайт), и показав, что это придаёт ему способность заражать человеческие клетки:

    Чтобы оценить потенциальные генетические изменения, необходимые для HKU4 для заражения клеток человека, мы изменили шиповидный белок HKU4, стремясь повысить его способность опосредовать проникновение вируса в клетки человека. С этой целью мы ввели две одиночные мутации, S746R и N762A, в белок HKU4.

    Следовательно, реинжинирированные мотивы hPPC и hECP позволили активировать спайк HKU4 человеческими эндогенными протеазами и тем самым позволили псевдовирусам HKU4 обойти необходимость проникновения экзогенных протеаз в клетки человека. Эти результаты показывают, что спайку HKU4 нужны только две одиночные мутации на границе S1/S2, чтобы получить полную способность опосредовать проникновение вируса в клетки человека.

    Исходный текст

    Кстати, то как они это сделали может людей далёких от современных биотехнологий напугать само по себе — потому что авторы вставили этот коронавирусный шиповидный белок в инактивированный ретровирус (ВИЧ):

    Вкратце, псевдотипированные ретровирусы MERS-CoV-spike, экспрессирующие репортерный ген люциферазы, были получены путем котрансфекции клеток HEK293T плазмидой, несущей геном ВИЧ-1, дефектный по Env, экспрессирующий люциферазу (pNL4–3.luc.RE-) и плазмидой, кодирующей MERS-CoV шиповидный белок.

    Исходный текст

    Быть может, именно это подвигло индийских исследователей на поиск схожих у ВИЧ и CoV2 последовательностей в геноме (но их препринт быстро раскритиковали за неудачную методологию и ошибочные выводы). На самом деле такие псевдовирусы специалисты используют регулярно, и вообще, не стоит огульно бояться ретровирусов как класс — их подвид лентивирусы используется для генной терапии уже много лет.

    Откуда взялся RaTG13


    Вообще, RaTG13 — феноменальный штамм. Странно, что все эти годы группа Ши Чжэнли о нём молчала. Ведь он совсем не похож на остальных своих собратьев, особенно в последовательности шиповидного белка, а это, напомню, именно то место, которое определяет к каким типам клеток (и каких видов) данный вирус сможет цепляться. Вот график схожести генома CoV2 в сравнении с другими летучемышиными коронавирусами (панель B):


    RaTG13 — это красная кривая, а синяя — это наиболее близкие к RaTG13 штаммы (ZXC21 и ZC45). Эти штаммы были выделены из Китайских подковоносов (Rhinolophus sinicus) в Чжоушане в 2015 (ZXC21) и 2017 (ZC45) годах. Как видно из графика, даже они очень сильно расходятся с RaTG13 (красная кривая) в районе S белка. При этом график выше не так хорошо передаёт масштаб пропасти между ними как прямое сравнение сиквенсов:


    Как видим, шиповидные белки ZXC21 и ZC45 не только, в целом, на 23–24 аминокислотных остатка короче белка RaTG13, но они короче в самом важном месте — в RBM (см. делеции в красном прямоугольнике, отмеченные красными прочерками).

    Так откуда же взялся RaTG13? Как я уже сказал, в 2020 году Ши Чжэнли сообщила, что выделила его у подковоносов (только вида Rhinolophus affinis, а не R. sinicus) в июле 2013 года в Юньнани. Правда, до конца января 2020 года публично о его существовании не сообщалось, а вот как описывает своё знаменательное открытие о его схожести с CoV2 сама группа Ши Чжэнли:

    Затем мы обнаружили, что короткий участок РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) от коронавируса летучей мыши (BatCoV RaTG13), который ранее был обнаружен у Rhinolophus affinis из провинции Юньнань, показал высокую идентичность последовательности 2019-CoV2. Мы провели полноразмерное секвенирование на этом образце РНК (регистрационный номер GISAID EPI_ISL_402131). Анализ Simplot показал, что 2019-CoV2 очень похож на RaTG13 (Fig. 1c), с общей идентичностью генома 96,2%.

    Исходный текст

    Негусто: ну был у них этот штамм «ранее обнаружен», и был. Лежал на полке. До 2020 года секвенировали в нём только часть генома, отвечающую за RdRp. Откуда он на полке взялся? В Юньнани в 2013 году выделили. Где именно? Не сказали. В GenBank тоже не было этой информации. Но, к счастью, в базе геномов GISAID была: сообщается, что в городе Пуэр (да, на родине любимого чая Басты) его выделили из fecal swab некого самца:


    Это меня немного заинтриговало, потому что в моих блужданиях по Пабмеду, я уже натыкался на экспедицию в Пуэр летом 2013 года:

    Летучие мыши были пойманы в различных местах в пяти округах четырех префектур провинции Юньнань, Китай, с мая по июль 2013 года.

    Исходный текст


    В той экспедиции ничего особо интересного для нас исследователи не нашли, но, быть может, именно тогда Ши Чжэнли (или кто-то из её группы?) выделил тот самый образец RaTG13? Который они секвенировали лишь частично, но почему-то решили не публиковать, хотя он весьма отличался от всего известного ранее.

    Сама Ши Чжэнли вполне могла лично участвовать в той экспедиции, потому что о таких экспедициях она отзывалась весьма тепло — например, в своём TED-like выступлении в 2018 году, где она показывала свои фотографии из таких экспедиций:



    Именно серия таких экспедиций и принесла ей мировую славу и прозвище «Бэтвумен»: в 2013 году в статье в Nature группа Ши Чжэнли триумфально объявила о том, что в пещерах Юньнани она обнаружила летучих мышей-носителей штаммов RsSHC014 и Rs3367, которые совпадали с первым SARS-CoV на 85% и 96% соответственно.

    Кстати, забавное совпадение, что примерно в то же время, в той же Юньнани группа Ши Чжэнли, оказывается, также обнаружила и штамм RaTG13, который оказался наиболее близок к CoV2, и их геномы тоже совпадают на 96%.

    «Ухань-1»


    Возвращаясь к той триумфальной статье от 2013 года, в ней же группа Ши Чжэнли ещё рассказала, что с помощью культивирования выделенных образцов в культуре обезьяньих клеток Vero, им удалось выделить живой вирус, который был практически идентичен штамму Rs3367 (наиболее близкому к SARS-CoV). Своё детище авторы окрестили WIV1 (где WIV обозначает Wuhan Institute of Virology):

    Что наиболее важно, мы сообщаем о первой изоляции живого вируса SL-CoV (летучемышиный SL-CoV-WIV1) из образцов, выделенных из фекалий летучей мыши, в клетках Vero E6, который имеет типичную морфологию коронавируса, идентичность генома на 99,9% с Rs3367 и использует ACE2 людей, цивет и подковоносов для проникновения в клетку. Предварительное тестирование in vitro показывает, что WIV1 также имеет широкий видовой тропизм.

    Исходный текст

    Давайте сравним RaTG13 со штаммами Rs3367 и RsSHC014:


    Как видим, шиповидный белок этих штаммов не только короче RaTG13-шного на 13 аминокислот, но и сильно отличается он него в первой его четверти. Кстати, любопытно, что шиповидные белки у Rs3367 (aka WIV1) и RsSCH014 практически идентичны, и различаются только в районе RBD (правый сиквенс ниже). Почти как CoV2 и RaTG13 (не считая фуриновой врезки):


    Мог ли какой-нибудь исследователь, получив в марте 2019-го образцы коронавируса из конфискованных таможней панголинов, захотеть проверить, насколько панголиний RBM тропен к человеческому рецептору? А если ещё и с polybasic фуриновым сайтом в самом интересном месте? Вот это будет бомба!

    Теоретически, конечно, мог бы. Ничего технически сложного для вирусологов в осуществлении таких экспериментов нет. Резонный вопрос: а зачем им для этого использовать RaTG13 в качестве основы, а не уже опробованный WIV1? Но вполне возможно, что химеру с WIV1 они тоже тестировали. А параллельно решили смоделировать вариант рекомбинации панголиньего вируса с более близким ему летучемышиным — ведь RaTG13 всё же ближе к панголиньим штаммам чем WIV1: его шиповидный белок ближе к ним и филогенетически, и структурно — он с ними даже по длине совпадает, в то время как белки WIV1/Rs3367 и RsSHC014 на 13 аминокислот короче панголиньих. Да и общая для RaTG13 и панголина-19 (MP789) мутация QTQTNS в районе протеазного сайта не может оставить равнодушной специалиста.

    Другие юньнаньские штаммы


    Кстати, другие исследователи в 2011 году тоже находили образцы коронавирусов у Юньнаньских Rhinolophus affinis.Самым интересным мне показался штамм LYRa11:


    Но и он весьма далёк от RaTG13, а куда ближе к Rs3367 (это тот штамм, что на 96% совпадает с первым SARS-CoV):


    А вот RaTG13, выделенный из тех же летучих мышей Rhinolophus affinis, что и LYRa11, на него похож меньше всего (левый бласт).

    Ну и наконец, ещё один Юньнаньский штамм (бесхитростно названный Yunnan2011), выделенный в 2011 году из другого подвида подковоносов, Rhinolophus pusillus, похож на RaTG13 ещё меньше чем LYRa11:


    Да и между собой Yunnan2011 и LYRa11 (правый бласт выше) не особо похожи, не считая высококонсервативную область S2. Кстати, что за бардак у них с названиями штаммов? То полностью год прописывают, то частично, а то и вовсе нет (Rs3367). То сначала идёт вид носителя (RaTG13), то потом (LYRa11). Ещё вот интересно, что обозначают TG, LY или SHC? Инициалы расшифровавшего геном?

    Ладно, перейдём уже от вирусной археологии к вирусной инженерии, а именно к пересадке ключевых участков шиповидного белка и прочим gain-of-function (GOF) экспериментам.

    1999: Первый химерный коронавирус


    Eсли вы думаете, что вся эта GOF-движуха с анализом того, что именно позволяет коронавирусам перепрыгивать с одного вида на другой началась в ответ на эпидемию первого SARS-а в 2002 году, вы ошибаетесь. Вирусологи экспериментировали с химерными коронавирусами задолго до этого. Вот, например, показательная статья от 1999 года от голландской группы Питера Роттиера из Утрехта с говорящим названием “Ретаргетинг коронавируса путем замены эктодомена в шиповидном белке: пересечение видового барьера”:

    Используя направленную РНК-рекомбинацию, мы сконструировали мутант вируса коронавирусного мышиного гепатита (MHV), в котором эктодомен шиповидного белка был заменен высоко дивергентным эктодоменом белка вируса инфекционного перитонита кошек. Полученный в результате химерный вирус, обозначенный fMHV, приобрел способность инфицировать клетки кошачьих и одновременно утратил способность заражать мышиные клетки в культуре.

    Исходный текст

    Кстати, похоже, что Ши Чжэнли стажировалось под руководством Питера Роттиера в Утрехте. По крайней мере, в 2005-ом она была в соавторах совместной статьи, где Утрехт был указан в качестве её аффилиации (но текущий адрес был уже указан в Шанхайском институте). Кстати, сама статья тоже весьма любопытна — в ней авторы исследовали что именно позволяет вирусам расширять свой видовой тропизм:

    Лишь небольшое количество мутаций в его шиповидном белке позволяет мышиному коронавирусу переходить от мышино-ограниченного тропизма к расширенному диапазону хозяев путем пассирования in vitro. Один такой вирус, который мы изучали, приобрел два предполагаемых гепарансульфатсвязывающих сайта, сохранив при этом фуриновый сайт в другом месте.

    Исходный текст

    Во-первых, любопытно, что фуриновый сайт в том вирусе (SRRAHR|SV) похож на сайт в CoV2 (SPRRAR|SV), хотя у CoV2 он режется более эффективно из-за сдвоенных аргининов (это и делает его polybasic сайтом, то есть у него в последовательности RxxR несколько основных аминокислот подряд):


    Но особенно статья любопытна тем, что мутации, позволившие вирусу “расширить свой кругозор”, произошли даже не в лабораторных животных, а в пробирке (by being passaged in vitro). Причем, похоже, происходили они довольно быстро:

    MHV/pi23 — вирус, полученный после 23 из 600 пассажей, приведших к MHV/BHK, также содержит предполагаемый HS-связывающий сайт в домене S1 в том же положении, что и в MHV/BHK, хотя и в виде меньшей вставки, в то время как у него отсутствует предполагаемый HS-связывающий сайт непосредственно перед пептидом слияния. MHV/pi23 способен инфицировать не мышиные клетки, хотя и менее эффективно, чем MHV/BHK. В дополнение ко множественным HS-связывающим сайтам, однако, мутации, обнаруженные в других частях белка S, таких как домен HR1 и предполагаемый пептид слияния (Fig. 1), также могут способствовать эффективному проникновению в немуринные клетки. В настоящее время мы находимся в процессе определения мутаций белка S, которые необходимы для фенотипа расширенного диапазона хозяев.

    Исходный текст

    Забегая вперёд, упомяну, что были и другие группы, которые пытались мутациями в пробирке увеличить вирулентность коронавируса, например MERS-а:

    Чтобы лучше понять адаптивность видов MERS-CoV, мы использовали субоптимальный вариант DPP4 для изучения вирусной адаптации. Пассирование вируса на клетках, экспрессирующих этот вариант DPP4, приводило к накоплению мутаций в вирусном шиповидном белке, которые увеличивали репликацию.

    Исходный текст

    Причём у них мутации возникали уже через несколько пассажей (раундов размножения клеточных культур):

    (F) Схема появления одиночных и двойных мутаций в шиповидном белке MERS-CoV в разных пассажах.
    (G) Расположение мутаций в шиповидном белке MERS-CoV.

    Исходный текст

    Но это всё будет гораздо позже. А пока давайте вернёмся в 2002 год — ещё ДО вспышки первого SARS-CoV.

    Как Барик всем путь озарил


    Ральф Барик — это человек-легенда в коронавирусологии. Настоящий первопроходец синтетических методик манипуляции вирусных геномов. Ещё в 2002 году он опубликовал прорывную работу, открывшую новую веху как в изучении различных механизмов природных вирусов, так и в gain-of-function (GOF) исследованиях. В своей работе группа Барика синтетически воссоздала клон природного мышиного коронавируса:

    Был разработан новый метод сборки полноразмерной инфекционной кДНК штамма вируса гепатита мыши коронавируса II группы А59 (MHV-A59). Были выделены семь сегментов кДНК, которые охватывали весь геном MHV размером 31,5 тысяч пар нуклеотидов. Концы кДНК были сконструированы с уникальными стыками и собраны только с соседними субклонами кДНК, в результате чего была получена интактная конструкция кДНК MHV-A59 длиной ~ 31,5 т.п.н. Сайты рестриктаз в местах стыков, которые располагались на концах каждого сегмента кДНК, систематически удалялись во время сборки полного полноразмерного продукта кДНК, что позволяет проводить повторную сборку без внесения нуклеотидных изменений… Этот метод потенциально может быть использован для конструирования вирусных, микробных или эукариотических геномов, достигающих нескольких миллионов пар оснований в длину и использоваться для вставки сайтов рестрикции в любом заданном месте в микробном геноме.

    Исходный текст


    То есть авторы, по сути, перевели РНК-вирус на язык ДНК (с помощью обратной транскриптазы), для того чтобы затем им было удобно манипулировать его геномом с помощью имеющихся инструментов генной инженерии. Создав 7 таких cDNA сегментов провируса, авторы затем их сшили, причем «бесшовно» (не оставляя следов), после чего перевели свою конструкцию обратно в РНК, из которой затем в других клетках сформировались вирусные частицы.

    SARS-2003


    Буквально спустя несколько недель после публикации той работы группы Барика грянула эпидемия SARS-CoV, и Ральф Барик не терял времени даром. Уже летом 2003 его группа отправила в печать работу по созданию синтетического клона SARS-CoV:

    Используя набор смежных сегментов кДНК, которые охватывают весь геном, мы собрали полноразмерную кДНК штамма SARS-CoV Urbani и выделили синтетические клоны вирусы SARS (инфекционный клон SARS-CoV), которые содержали ожидаемые маркерные мутации, вставленные в клоны. Рекомбинантные вирусы реплицировались так же эффективно, как вирус дикого типа, и оба были ингибированы обработкой ингибитором цистеинпротеиназы… Наличие полноразмерной кДНК SARS-CoV создаёт инструмент для манипулирования вирусным геномом, позволяя быстро и рационально разрабатывать и тестировать кандидаты вакцин и терапевтических средств против этого важного человеческого патогена.

    Исходный текст


    Скорость группы Барика позволяет понять, как быстро квалифицированная команда вирусологов может создать синтетический клон из природного вируса, а значит и вносить в него генетические модификации. Причём это было в 2003 году. Сегодня всё то же самое квалифицированная лаборатория может повторить за считанные недели.

    SARS-2006


    Барик был первым, но далеко не последним. Генная инженерия развивалась семимильными шагами, создавая всё новые и новые инструменты. Другие группы отрабатывали альтернативные технологии синтетической вирусологии. Например, в 2006 испанские исследователи повторили достижения Барика, тоже создав синтетический клон SARS, но с помощью другой технологии (искусственной бактериальной хромосомы):

    В данном исследовании описана разработка полноразмерного инфекционного клона кДНК и функционального репликона штамма Urbani коронавируса SARS-CoV с помощью бактериальных искусственных хромосом (BAC). В этой системе вирусная РНК экспрессировалась в ядре клетки под контролем промотора цитомегаловируса и затем амплифицировалась в цитоплазме вирусной репликазой. И инфекционный клон, и репликон были полностью стабильны в Escherichia coli.

    Собранный инфекционный клон кДНК SARS-CoV был полностью стабилен при размножении в клетках E.coli DH10B в течение более 200 поколений, что значительно облегчало генетические манипуляции с вирусным геномом (данные не показаны). Подробная стратегия клонирования и плазмидные последовательности доступны по запросу.

    Исходный текст


    Правда, сделали они это не так элегантно как Барик, так как в финальной сборке синтетического вируса у них остались добавленные сайты рестриктаз, в то время как Барик научился соединять фрагменты «бесшовно». Но это мелочи, подход испанцев тоже вполне рабочий — в 2013 году с его помощью они создали синтетический клон MERS-a, а в 2015 году их методика вошла в учебник-справочник по коронавирусам (глава 13):

     

    Ухань-2007


    Но вернёмся в 2007 год. Тогда в гонку синтетической вирусологии включилась и группа Ши Чжэнли с работой, изучавшей шиповидный белок человеческого и летучемышиного коронавирусов, пытаясь определить, что именно в нём отвечает за способность перескакивать с вида на вид:

    Ряд химерных шиповидных белков был сконструирован путем вставки различных последовательностей шиповидного белка SARS-CoV в основу из белка SL-CoV.

    Исходный текст

    То есть авторы вставляли разные отрезки из белка человеческого SARS-CoV в белок летучемышиного вируса. Вот их вывод:

    Из этих результатов было установлено, что область от 310 до 518 в шиповидном белке BJ01 была необходимой и достаточной для получения шиповидным белком Rp3 способности связывания с человеческим ACE2.

    Исходный текст

    При этом они пробовали заменять и более короткие фрагменты, включая только RBM:

    Для вставки RBM из SARS-CoV в шиповидный белок SL-CoV, использовалась кодирующая область от 424 до 494 аминокислоты в шиповидном белке BJ01 для замены соответствующих областей в белке Rp3, в результате чего был получен химерный ген шиповидного белка (CS), обозначенный как CS424–494.

    Исходный текст

    С учётом того, что это было написано в 2007 году, думаю, сегодня произвести замену RBM одного вируса на другой не составит труда даже начинающему вирусологу.

    Химера-2015


    В свете вышеописанных экспериментов, не очень понятно, чем именно был вызван тот фурор, которая произвела, наверное, самая нашумевшая gain-of-function публикация. Речь, конечно же, о совместной работе Ши Чжэнли и Ральфа Барика, в которой они создали синтетический химерный вирус:

    Используя систему обратной генетики SARS-CoV, мы создали и охарактеризовали химерный вирус, экспрессирующий шиповидный белок коронавируса летучей мыши SHC014 в мышиноадаптированной основе SARS-CoV. Результаты показывают, что вирусы группы 2b, кодирующие шиповидный белок SHC014 в основе дикого типа, могут эффективно использовать несколько ортологов человеческого рецептора SARS (ACE2), эффективно реплицироваться в первичных клетках дыхательных путей человека и достигать титров in vitro, эквивалентных эпидемическим штаммам SARS-CoV. Кроме того, эксперименты in vivo демонстрируют репликацию химерного вируса в легких мыши с заметным патогенезом. Оценка доступных иммунотерапевтических и профилактических методов на основе атипичной пневмонии показала низкую эффективность; подходы как к моноклональным антителам, так и к вакцинам не смогли нейтрализовать и защитить от инфицирования CoV с новым шиповидным белком. На основании этих результатов мы синтетически воспроизвели инфекционный полноразмерный рекомбинантный вирус SHC014 и продемонстрировали репликацию вируса как in vitro, так и in vivo.

    Исходный текст

    То есть, по сути, исследователи шли уже проторённой дорогой: взяли шиповидный белок из RsSHC014, который Ши Чжэнли выделила из юньнаньских летучих мышей в 2011 году, и вставили его в SARS-CoV, специально адаптированный под рождённых ползать мышей, для последующих in vivo экспериментов на этих самых мышах. Ну и на человеческих клетках новую конструкцию проверили. А заодно поупражнялись в создании рекомбинантного клона того же самого RsSHC014 — ну а почему бы и нет? Ведь, во-первых, это красиво:

    (a) Схема молекулярного клона SHC014-CoV, который был синтезирован в виде шести смежных сегментов кДНК (обозначенных как SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E и SHC014F), фланкированных уникальными рестриктазными сайтами BglI, которые обеспечили направленную сборку полноразмерной экспрессии кДНК (для 1a, 1b, спайка, 3, конверт, матрица, 6–8 и нуклеокапсид). Подчеркнутые нуклеотиды представляют собой выступающие последовательности, образованные после расщепления рестриктазой.

    Исходный текст

    А во-вторых, исследователи поняли, что не только тропностью шиповидного белка к рецептору определяется потенциал вируса к переходу из одного вида животных на другой — потому что химера SHC014-MA15 была более вирулентной чем сам SHC014, даже в человеческих клетках:

    Примечательно, что дифференциальный тропизм в легких по сравнению с таковым у SARS-MA15 и ослабление полноразмерного SHC014-CoV в культурах [эпителиальных дыхательных путей человека] относительно SARS-CoV Urbani позволяют предположить, что помимо связывания с ACE2 и другие факторы — включая процессивность шиповидного белка, биодоступность рецептора или антагонизм иммунных ответов хозяина — могут способствовать вирулентности.

    Исходный текст

    Особо хочу выделить процессивность шиповидного белка в цитате, потому что это далеко не первый раз когда исследователи писали, что способность шиповидного белка к расщеплению протеазами (включая фурин) оказывает значительное влияние на вирулентность.

    В заключение темы — совместное фото Ральфа Барика и Ши Чжэнли. Фото сделано в Ухане, в октябре 2018-го:

     

    Мышиный SARS-2007


    Тут не могу не упомянуть, что это был за “мышиный вирус MA15” в предыдущей работе. Это вовсе не какой-то природный мышиный коронавирус, как можно было бы предположить. А это лабораторно модифицированный человеческий SARS-CoV, который ещё в 2007-ом та же группа Барика — видимо соревнуясь с группой Ши Чжэнли (помните их статью от 2007 года) – превратила в настоящего мышиного убийцу. Для этого они его сначала итеративно “улучшали” на мышах, а когда он через несколько итераций стал максимально “эффективным”, они воспроизвели возникшие в мышах мутации в синтетическом клоне нового вируса, и ещё раз проверили, что он действительно обладает повышенной инфективностью:

    Мы адаптировали SARS-CoV (штамм Urbani) путем серийного пассирования в дыхательных путях молодых мышей BALB/c. Пятнадцать пассажей привели к вирусу (MA15), который является летальным для мышей после интраназальной инокуляции. Смертельности предшествует быстрая репликация вируса с высоким титром в легких, виремия и распространение вируса на внелёгочные участки, сопровождающиеся лимфопенией, нейтрофилией и патологическими изменениями в легких. Обильный вирусный антиген широко распространен в эпителиальных клетках бронхов и альвеолярных пневмоцитах, а некротический клеточный дебрис присутствует в дыхательных путях и альвеолах с легким и очаговым пневмонитом. Эти наблюдения показывают, что мыши, инфицированные МА15, умирают от подавляющей вирусной инфекции с обширным, опосредованным вирусом разрушением пневмоцитов и реснитчатых эпителиальных клеток. Вирус MA15 имеет шесть кодирующих мутаций, связанных с адаптацией и повышенной вирулентностью; при введении в рекомбинантный SARS-CoV эти мутации приводят к высоковирулентному и летальному вирусу (rMA15), дублирующему фенотип биологически полученного вируса MA15. Интраназальная инокуляция МА15 воспроизводит многие аспекты заболевания, наблюдаемые в тяжелых случаях SARS у человека.

    Исходный текст

     

    Барик-2008


    Кстати, о соперничестве Барика и Ши Чжэнли. Параллельно с пересадкой RBD от человеческого SARS-CoV в мышиный, его группа создавала такие же химеры и с летучемышиными штаммами. В 2008 году группа Барика взяла летучемышиный штамм Bat-SCoV и заменила в нём RBD в шиповидном белке на RBD из человеческого SARS-а. То есть, по сути, повторила работу Ши Чжэнли от 2007 года, только не ограничившись псевдо-вирусами, а создав самый настоящий химерный коронавирус — причём не какой-то мышиный как в работе 2015 года, а самый что ни на есть человеческий. Своим достижением авторы явно гордились:

    Здесь мы сообщаем о разработке, синтезе и выделению самой крупной синтетической реплицирующейся жизненной формы размером 29,7 килобаз — коронавируса летучей мыши (Bat-SCoV), подобного тяжелому острому респираторному синдрому (SARS), вероятного предшественника эпидемии SARS-CoV.

    Чтобы проверить, являются ли RBDs Bat-SCoV и SARS-CoV взаимозаменяемыми, мы заменили RBD Bat-SCoV (аминокислоты 323–505) на RBD SARS-CoV (аминокислоты 319–518) (27, 28) (GenBank регистрационный номер FJ211860), имитирующий теоретическую рекомбинацию, которая может произойти во время смешанной инфекции in vivo (Fig. 1B).

    Исходный текст

    (B) Схематическое изображение, показывающее организацию шиповидных белков SARS-CoV и Bat-SCoV. Спроектированные белки изображены ниже с названием вируса слева. Bat-SRBD включает всю последовательность шиповидного белка Bat-SCoV, за исключением того, что RBD Bat-SCoV (аминокислоты Bat-SCoV 323–505) заменен на RBD SARS-CoV (аминокислоты 319–518) (инвентарный номер GenBank FJ211860 ). Bat-SRBD-MA включает изменение RBD в шиповидном белке MA15 на SARS-CoV Y436H. Bat-SRBM включает минимальные 13 остатков SARS-CoV, критических для контакта с ACE2, что приводит к химерному RBD с аминокислотами 323I-429T Bat-SCoV и аминокислотами 426R-518D SARS-CoV. Bat-Hinge представляет собой последовательность Bat-SRBM, где аминокислоты Bat-SCoV 392L-397E заменены на аминокислоты SARS-CoV 388V-393D. Bat-F включает нуклеотидную последовательность 1–24057 SARS-CoV (до аминокислоты 855 в шиповидном белке) с оставшейся 3'-последовательностью из Bat-SCoV. Справа от схематических изображений указаны наблюдаемые данные по транскрипционной активности и приблизительные титры на 1-м пассаже (P1). ND указывает, что инфекционный вирус не обнаружен.

    Исходный текст

    Барик-2016


    В творчестве Барика вообще много римейков. Например, в 2016-ом году он практически повторил ту самую совместную работу с Ши Чжэнли от 2015 года по созданию химерного вируса, только на этот раз он вставил в мышиноадаптированный SARS кусок шиповидного белка не из RsSCH014, а из другого найденного Ши Чжэнли в Юньнани его близкого родственника — Rs3367. Ну или, если быть совсем точным, то из штамма WIV1 — лабораторного клона Rs3367, выращенного в клеточной культуре в Уханьском институте вирусологии в 2013 году. Вот что именно сделала в 2016 году группа Барика:

    Используя инфекционный клон SARS-CoV в качестве матрицы (7), мы разработали и синтезировали полноразмерный инфекционный клон WIV1-CoV, состоящий из шести плазмид, которые можно было бы ферментативно разрезать, лигировать вместе и электропорировать в клетки, для получения репликационно компетентных вирионов (рис. S1A). В дополнение к полноразмерному клону мы также создали химерный вирус WIV1-CoV, который заменил шиповидный белок в SARS на белок из WIV1 в адаптированной для мыши основе (WIV1-MA15, рис. S1B). … Для подтверждения кинетики роста и репликации клетки Vero были инфицированы SARS-CoV Urbani, WIV1-MA15 и WIV1-CoV.

    Исходный текст


    То есть, по большому счёту, в 2016 году Барик клонировал свою статью от 2015 года. Более того, её смысл мне не очень понятен: ведь WIV1/Rs3367, если помните, и так на 96% совпадал с SARS-CoV (за это Ши Чжэнли и получила известность). Поэтому зачем обратно в SARS-CoV вставлять шиповидный белок из его ближайшего родственника мне не очень ясно. Быть может, просто из любви к искусству. В этом свете заголовок его статьи приобретает некую двойственность: “SARS-подобный WIV1-CoV готов к переходу на человека”. Почему-то в голову сразу приходит этот кадр:


    Ещё мне не понятно как в 2015 году Барик сумел получить патент на создание «химерных коронавирусных шиповидных белков», с учётом того, что всё это и он, и Ши Чжэнли публиковали задолго до 2015-го.

    Барик-1990


    Ладно, последний штрих к портрету Ральфа Барика. Он не просто старожил этой области, а занимался дизайном рекомбинантных коронавирусов ещё до всяких сиквенаторов и прочих современных инструментов генной инженерии. Вот его статья по созданию “температурных мутантов” из мышиного коронавируса от аж 1990-го года:

    На протяжении всего этого исследования использовали штамм вируса гепатита мыши A59 (MHV-A59). Вирус размножали и клонировали три раза в непрерывной клеточной линии астроцитомы мыши (DBT).

    Различные комбинации температурно-чувствительных мутантов смешивали и инокулировали в клетки при множественности заражения, равной 10.

    Исходный текст

    Так что созданием различных вирусных мутантов Барик занимается уже более 30 лет.

    Барик-2019


    И, к слову сказать, даже сейчас темпов не снижает. В конце октября 2019-го его группа подала на публикацию очередную статью о важной роли фуринового сайта в шиповидном белке для преодоления коронавирусами «барьера для зоонозной инфекции»:

    Вместе эти результаты демонстрируют, что протеазное расщепление также является основным барьером для инфекции клеток Vero с помощью HKU5-CoV. Рассматривая далее, мы сравнили предсказанное расщепление на границе S1/S2, S2’ и сайте эндосомной цистеиновой протеазы в шиповидных белках MERS, PDF2180 и HKU5 (Fig. 6D) (26). В сайте S1/S2 MERS, Uganda и HKU5 поддерживают сайт расщепления RXXR, хотя различные внутренние аминокислоты могут влиять на его эффективность. Для последовательности S2' MERS и HKU5 также сохраняют мотив RXXR; однако в шипах штамма Uganda отсутствует первый аргинин (SNAR), что потенциально влияет на его расщепление.

    Исходный текст

    Памятуя о соревновательном духе между группами Барика и Ши Чжэнли, интересно, какова вероятность, что в Ухане в конце 2019 года кто-то тоже занимался подобными исследованиями?

    Gain-of-Function: «Запретить нельзя продолжить»


    Многие, кто впервые слышит о вышеописанных исследованиях, задаются резонным вопросом: «А нафига?» Зачем учёные создают химерные вирусы-убийцы? Политкорректный ответ: для разработки превентивной защиты (вакцин и препаратов) от возможных природных химер и для понимания рисков их возникновения. Вот, собственно, что сами Барик и Ши Чжэнли с соавторами писали на эту тему в той самой статье 2015 года:

    В дополнение к подготовке против будущих появляющихся вирусов, этот подход должен быть рассмотрен в контексте предписанной правительством США паузы в исследованиях усиления функции (GOF). На основании предыдущих моделей (Fig. 4a, b) создание химерных вирусов, таких как SHC014-MA15, не ожидалось, что увеличится его патогенность. Хотя SHC014-MA15 аттенуирован по сравнению с его родительским мышиноадаптированным SARS-CoV, аналогичные исследования, изучавщие патогенность CoV с шипом Urbani дикого типа в основе MA15, не показали потери веса у мышей, показали сниженную репликацию вируса. Таким образом, по отношению к шиповидному белку Urbani-MA15 CoV, SHC014-MA15 демонстрирует усиление патогенеза (рис. 1). На основании этих результатов надзорные научные комитеты могут посчитать подобные исследования с созданием химерных вирусов, основанных на циркулирующих штаммах, слишком рискованными, поскольку нельзя исключать повышение патогенности в млекопитающих. В сочетании с ограничениями на адаптированные к мышам штаммы и разработкой моноклональных антител с использованием побочных мутантов, исследования появления новых коронавирусов и терапевтической эффективности могут быть серьезно ограничены в будущем. Вместе эти данные и ограничения представляют собой перекресток озабоченности GOF; потенциал для подготовки к будущим вспышкам и смягчения их последствий должен быть сопоставлен с риском создания более опасных патогенных микроорганизмов. При разработке политики в будущем важно учитывать ценность данных, полученных в результате этих исследований, и то, заслуживают ли эти типы исследований химерных вирусов продолжения в сравнении с присущими им рисками.

    Исходный текст

    Были ли эти слова пророческими? В конце 2014-го года США ввели мораторий на государственное финансирование таких gain-of-function исследований, но почти сразу (в 2017-ом) отменили. А в Китае никакого моратория на такие исследования не вводили, а даже наоборот открывали новые «супер(без)опасные лаборатории» уровня BSL-4, как в 2017 году в Ухане:


    На всякий случай, поясню, что до 2017 года лаборатория в Уханьском институте вирусологии была класса BSL-3, которого было достаточно для работы с коронавирусами. Приведу пару цитат из вышеприведённой заметки о создании уханьской BSL-4 лаборатории:

    В планах на будущее — изучение патогена, вызывающего атипичную пневмонию, для которого также не требуется лаборатория BSL-4, прежде чем перейти к изучению вируса Эбола и западноафриканского вируса Ласса. Около миллиона китайцев работают в Африке; страна должна быть готова к любой ситуации, говорит Юань. «Вирусы не знают границ».

    План по расширению сети усиливает такие опасения. Одна лаборатория BSL-4 в Харбине уже ожидает аккредитации; следующие две, как ожидают, будут в Пекине и Куньмине, последняя сосредоточился на использовании обезьян для изучения болезней.

    Лина говорит, что размер Китая оправдывает такой размах, и что возможность объединить исследования BSL-4 с обилием исследовательских обезьян — китайские исследователи сталкиваются с гораздо меньшим количеством бюрократических проволочек, чем на Западе, когда дело доходит до исследований на приматах — может быть мощной. «Если вы хотите протестировать вакцины или противовирусные препараты, вам нужна модель приматов, отличных от человека», — говорит Лина.

    Но Эбрайт не убежден в необходимости более одной лаборатории BSL-4 в материковом Китае. Он подозревает, что расширение там является реакцией на сети лабораторий в Соединенных Штатах и Европе, что, по его словам, также неоправданно. Он добавляет, что правительства будут предполагать, что такая избыточная мощность предназначена для потенциального развития биологического оружия.

    «Эти объекты по своей сути предназначены для двойного использования», — говорит он. Перспектива расширения возможностей для введения обезьянам патогенных микроорганизмов также беспокоит, а не вдохновляет его: «Они могут бегать, они могут царапать, они могут кусать».

    Треван говорит, что инвестиции Китая в лабораторию BSL-4 могут, прежде всего, стать способом доказать миру, что страна конкурентоспособна. «Это большой статусный символ в биологии, — говорит он, — вне зависимости от того, нужны они или нет».

    Исходный текст

    Интересно, что помимо Уханя, новую BSL-4 лабораторию планировали открыть в Куньмине, причём с прицелом на тестирование вакцин на приматах. Куньмин, напомню, это столица Юньнани. Именно в близлежащих пещерах Ши Чжэнли обнаружила те самые штаммы Rs3367 и RsSHC014. Кстати, тестирование на приматах упоминалось в качестве возможных дальнейших шагов для разработки превентивных вакцин против потенциальных будущих вспышек коронавируса в «той самой» (сколько раз я её уже так назвал?) статье Барика и Ши Чжэнли:

    Тем не менее, требуется дальнейшее тестирование на нечеловеческих приматах, чтобы перевести эти находки в патогенный потенциал у людей. Важно отметить, что недостаток доступных терапевтических средств определяет критическую необходимость дальнейшего изучения и разработки методов лечения. Обладая этими знаниями, можно разработать программы эпиднадзора, диагностические реагенты и эффективные методы лечения, которые могут защитить от появления коронавирусов, специфичных для группы 2b, таких как SHC014, и могут применяться к другим коронавирусным ветвям, которые поддерживают аналогичные гетерогенные пулы.

    Исходный текст

    Вполне возможно, что к 2019 году создание и тестирование потенциальных вакцин от различных SARS-like коронавирусов уже шло полным ходом.

    О сколько эпидемий чудных готовит просвещенья дух…


    Ну что ж, давайте уже рассмотрим версию о лабораторной утечке. Для начала приведу краткую историческую справку о других утечках. Потому что побеги вирусов из лабораторий в прошлом случались неоднократно. В первую очередь, того же SARS-CoV: впервые он сбежал летом 2003 года в Сингапуре, потом в декабре 2003 на Тайване, а весной 2004 дважды утекал в Пекине.

    Были тревожные звоночки и в Европе и США, хотя там обошлось без заражений. Например, во Франции лаборатория как-то потеряла пробирки с SARS-ом, а в США BSL-4 лаборатория в Техасе недосчитались пробирки с вирусом венесуэльской геморрагической лихорадки:

    Только один ученый работал с вирусом, и Рейес сказал, что лаборатория подозревает, что ученый случайно выбросил пробирку в ноябре.

    В Галвестонской биолаборатории самые строгие меры безопасности, потому что она изучает материалы уровня биологической безопасности BSL-4, то есть опасные инфекционные заболевания, которые не имеют вакцин или лекарств. Материалы BSL-4 включают Guanarito, Эболу и оспу.

    Исходный текст

    История знает и другие, куда более широкомасштабные утечки. Например, «воскрешение» вируса гриппа H1N1 в 1977 году, который до этого считался исчезнувшим. Да, это вирус той самой «испанки»:

    Вирусы человеческого гриппа H1N1 появились с пандемией 1918 года и сохранялись, накапливая небольшие изменения в геноме (с серьезными изменениями в 1947 году), пока в 1957 году не появился «азиатский» грипп H2N2, вызвавший всемирную пандемию. Вирус гриппа H1N1, по-видимому, вымер, и не выделялся в течение 20 лет. В 1969 году вирус H3N2 в Гонконге заменил вирус H2N2 и продолжает циркулировать.

    В сентябре 1977 г. вирус гриппа H1N1 был выделен из больных в дальневосточном регионе Советского Союза, а в начале 1978 г. китайцы сообщили, что в мае 1977 г. они выделили вирус H1N1 на северо-востоке Китая, в регионе, прилегающем к месту советской вспышки. Используя ранние генетические инструменты, доступные в то время, было обнаружено, что вирус H1N1 1977 года тесно связан с вирусами человеческого гриппа H1N1, циркулировавшими в 1949–1950 годах, но не с теми, которые циркулировали раньше или позже.

    Только начиная с 2009–2010 гг. в научных работах стало прямо указываться, что появление гриппа H1N1 в 1977 году было лабораторной утечкой: «Наиболее известный случай утечки лабораторного штамма — это вновь возникший вирус гриппа A H1N1, который впервые был обнаружен в Китае в мае 1977 года и вскоре после этого в России».

    Предположение о том, что утечка 1977 г. могла быть связана с исследованиями вакцин против H1N1, подтверждается наблюдением, что в начальных вспышках в Китае девять из десяти вирусных изолятов выражали «температурную чувствительность» (Kung 1978). Чувствительность к температуре, как правило, необычная черта, но в 1970-х годах она была (и всё ещё остается) фундаментальной чертой для создания ослабленных живых вакцин против гриппа. Чувствительность к температуре обычно возникает только после серии существенных лабораторных манипуляций и отборов.

    Интересно, что дальнейшие исследования показали, что циркулирующие штаммы в 1977–78 гг. часто состояли из смешанных температурно-чувствительных и нормальных компонентов, и что чувствительность к температуре, по-видимому, быстро исчезла из штамма H1N1 после 1978 г. Утечка штамма H1N1, проходящего лабораторное ослабление путём создания чувствительных к температуре мутантов, могла обеспечить как раз такую смешанную популяцию. В 1976–77 годах лабораторный персонал младше 20 лет не был знаком со штаммами гриппа H1N1 до 1957, поэтому мог быть подвержен инфицированию в лаборатории. Низкая тяжесть пандемии 1977 года может быть отчасти обусловлена чувствительностью вируса к температуре, что ограничивает репликацию вируса в легочных тканях.

    Исходный текст

    Похоже, создание температурно-чувствительных вирусных мутантов для разработки потенциальных «ослабленных» вакцин было широко распространено в конце ХХ века. Если помните, в 1990-м Барик тоже экспериментировал с созданием температурно-чувствительных штаммов.

    Могло ли что-то подобное стать причиной коронавирусной пандемии 2019-го? Почему нет? Тут возможно несколько вариантов — от разработки потенциальной вакцины до просто исследовательских работ по лабораторной рекомбинации летучемышиного и панголиньего вирусов. Какой-нибудь особо амбициозный исследователь мог даже просто по личной инициативе решить объединить две «модные темы» — добавление фуринового сайта и пересадку RBM из штамма одного вида (панголины) в другой (летучие мыши), чтобы потом, подтвердив повышенную вирулентность новой химерной конструкции, выпустить очередную грозную статью о том, какая опасность поджидает человечество в юньнаньских пещерах или на мокрых рынках. А если ещё и вакцину против такого опасного штамма удалось бы превентивно создать, то почёт и уважение такому исследователю были бы гарантированы.

    Утверждаю ли я, что так всё и было? Конечно же, нет. Потому что на сегодняшний день доказательства такого сценария отсутствуют. Есть только череда странных совпадений — например, что вспышка юньнаньского коронавируса произошла за тысячи километров от Юньнани именно на том рынке, который ближе всего к Уханьскому институту вирусологии. А может, и не на рынке, так как из первых 4-х заболевших пациентов, трое на рынке не бывали. Ну и совпадения по структурным особенностям генома вируса, которые напоминают те манипуляции, которые вирусологи не раз проводили с такими вирусами в лаборатории. Но совпадения — это ещё не доказательства.

    Более того, совпадения случаются, и, конечно же, в природе такой штамм тоже вполне мог возникнуть. Пока не очень ясно как именно — для этого летучемышиный и панголиний штаммы должны были встретиться в одной клетке (клетке чьего-то организма, а не металлической), причём в Ухане, так как вспышка произошла именно там (иначе мы бы видели другие очаги Ковида по пути следования первого зооносителя в Ухань). С учётом того, что летучие мыши на уханьском рынке не продавались, и вообще в это время года в спячке, такой вариант всё ещё остаётся неразгаданной тайной.

    Кстати, совсем недавно появилась новость, что в 2018-ом году американские специалисты проводили инспекцию Уханьского института вирусологи, и даже общались с Ши Чжэнли. Результатом их «экскурсии» стали две дипломатических телеграммы в Вашингтон, в которых они отметили ряд слабых мест в обеспечении безопасности лаборатории:

    Источники, знакомые с телеграммами, сказали, что они должны были поднять тревогу по поводу серьезных проблем безопасности в лаборатории WIV, особенно в отношении её работы с коронавирусами летучих мышей. Сотрудники посольства призывали к тому, чтобы США уделяли больше внимания этой лаборатории и оказывали ей дополнительную поддержку.

    «Во время взаимодействия с учеными из лаборатории WIV они отметили, что в новой лаборатории существует серьезная нехватка надлежащим образом подготовленных технических специалистов и исследователей, необходимых для безопасной эксплуатации этой лаборатории с высоким уровнем защиты», — говорится в телеграмме от 19 января 2018 года, которую подготовили два сотрудника отдела охраны окружающей среды, науки и здравоохранения посольства, лично встречавшиеся с учеными из WIV. (Государственный департамент отказался комментировать эту и другие детали истории.)
    Китайские исследователи в WIV получали помощь от Галвестонской Национальной лаборатории в Медицинском отделении Университета Техаса и других организаций в США, но китайцы обратились за дополнительной помощью. В телеграммах утверждается, что Соединенные Штаты должны оказать дальнейшую поддержку лаборатории в Ухане, главным образом потому, что их исследование коронавирусов летучих мышей было важным, но также и опасным.

    Исходный текст

    Забавно, что уханьцам помогала та самая техасская лаборатория в Галвестоне, которая в своё время сама потеряла пробирку с венесуэльским вирусом. Причём помогала она не только на словах, там действительно проходили обучение уханьские специалисты, о чём даже писал «уханьский вестник» (правда, сейчас публикацию с сайта удалили, но на вебархиве она пока доступна):


    Последний штрих к семейному портрету лабораторных утечек: в ноябре 2019-го в Ланьчжоу сразу в двух исследовательских центрах произошла вспышка бруцеллёза (бактериальной инфекции), поразившая более 100 работавших там исследователей.

    Возможные следы рукотворности


    Засим оставим вирусологов в покое и обратим наш взор опять на сам вирус. Есть ли в нём какие-то явные признаки рукотворности? Для начала пару слов о том, что значит «явные». Понятно, что в природе могут произойти любые мутации совершенно случайно. Даже если бы врезка, создавшая фуриновый сайт в CoV2 была не “PRRA”, а “MADEINWVHANPRRA”, то всё равно оставался бы ненулевой шанс, что она могла возникнуть случайно. Но для нас, да и для любого суда, думаю, этого было бы достаточно, чтобы доказать рукотворное происхождение beyond a reasonable doubt.

    Главная проблема с такими доказательствами состоит в том, что даже в рукотворном вирусе их попросту может не быть. Грубо говоря, хороший генный инженер может создать синтетический вирус «идентичный натуральному». Более того, часто исследователи намеренно привносят в свои конструкции какие-нибудь синонимичные мутации для того, чтобы потом можно было различить их штамм и природный. Но если создатель вируса эти маркеры рукотворности сам не раскрывает, отличить их от природных мутаций невозможно.

    Но иногда следы могут и оставаться, особенно если создатели не пытаются скрыть рукотворность своей конструкции. В первую очередь, речь о местах разрезов ДНК (напомню, что манипуляции с РНК-вирусами проводятся именно в комплементарных им ДНК-конструкциях), необходимых создателям для сшивания разных сегментов генома или для вырезания старых и вставки новых участков. Ведь ДНК можно разрезать не в произвольных местах (Криспер не в счёт), а только там, где последовательность нуклеотидов (обычно 4–6 «букв») совпадает с той последовательностью, которую распознаёт та или иная рестриктаза, то есть фермент, расщепляющий цепочки нуклеотидов. При этом такой анализ осложняет то, что существуют сотни различных типов рестриктаз, используемых в генной инженерии. Но давайте попробуем провести такой анализ для CoV2.

    Для начала — пример работы группы Барика от 2008 года, где они взяли Bat-SCoV и заменили RBD в его шиповидном белке на RBD из человеческого SARS-а. Вот как они описывают создание своей химеры:

    Схематическое представление вариантов SARS-CoV и Bat-SCoV.
    (A) Схематическое представление геномов SARS-CoV и Bat-SCoV (инвентарный номер GenBank FJ211859) и системы обратной генетики. (Вверху) стрелки указывают сайты процессинга вирусной протеазы nsp внутри полипротеина ORF1ab (открытые стрелки, папаин-подобная протеаза; закрашенные стрелки, nsp5 [3C-подобная протеаза]). Сразу ниже приведены фрагменты, использованные в системе обратной генетики, обозначенные от A до F. Фрагменты, синтезированные для создания Bat-SCoV, точно воспроизводят соединения фрагментов SARS-CoV, за исключением того, что Bat-SCoV имеет 2 фрагмента, Bat-E1 и Bat-E2, которые соответствуют фрагменту SARS-E.

    Исходный текст

    Как видим, сначала группа Барика создала синтетический клон летучемышиного Bat-SCoV, причём «по лекалам» уже созданного ими ранее синтетического клона SARS-CoV. То есть для летучемышиного клона они использовали те же 6 сегментов с теми же сайтами рестриктаз, которые ранее они использовали для SARS-CoV, что позволило им менять местами сегменты вируса между разными штаммами как куски Лего. Вот подробное описание создания химерного мутанта:

    Вирусы, содержащие ПЦР-генерированные вставки в вирусный геном, были получены с использованием стратегии сборки SARS-CoV (24, 33, 53) со следующими модификациями. Вкратце, для вируса Bat-F кДНК полной длины конструировали путем лигирования продуктов рестрикции из фрагментов A-E SARS-CoV и фрагмента F Bat-SCoV, что требовало расщепления Bgl-NotI. Для Bat-SCoV и Bat-SRBD, Bat-SRBM и Bat-Hinge плазмиды, содержащие 7 фрагментов кДНК генома Bat-SCoV, были расщеплены с использованием BglI для Bat-A, Bat-B, Bat-C и Bat -D, BglI и AflII для Bat-E1 и Bat-E2 и BglI и NotI для Bat-F. Расщепленные, очищенные фрагменты одновременно лигировали вместе. Транскрипция осуществлялась с использованием набора m7Message mMachine (Ambion), затем РНК электропорировали в клетки Vero (24, 53).

    Исходный текст

    Все эти трёхбуквенные аббревиатуры (BglI, AflII,NotI и т.д.) в выделенном выше предложении и являются различными типами рестриктаз. Давайте посмотрим, будут ли заметны какие-то различия в сайтах рестриктаз в геноме (шиповидного белка) химеры в сравнении с геномом исходного SARS-CoV:


    Как видно, сайты рестриктаз у химеры практически идентичны тем кускам исходных последовательностей в Bat-SCoV или SARS, откуда они были взяты. Единственные различия заметны в местах сшивания вставленного куска из SARS. Вот, например левый (5’-) край вставки:


    Здесь у Bat-SCoV и SARS оказалась общая идентичная область нуклеотидов (пересечение бирюзовой и розовой областей), и в месте сшивки двух последовательностей никаких новых сайтов рестриктаз нет, а наоборот пропал сайт SspI из SARS-а. А вот правый (3’-) край вставки:


    Тут в месте склеивания наоборот остались все старые рестриктазные сайты, и даже появились новые, например, EcoRII. Если бы я не знал, что химерный геном является следствием рукотворных манипуляций, смог бы я это понять, глядя на эти 3 сиквенса? Вряд ли, даже если бы у меня и закрались какие-то подозрения, то точно не beyond a reasonable doubt. Быть может, специалистам в генной инженерии это было бы видно по каким-то другим признакам, утверждать не берусь — здесь буду рад любому ликбезу.

    Но в любом случае, давайте сравним шиповидный белок у RaTG13, CoV2 и панголина-19. Вдруг там что-нибудь на нас как выскочит, как выпрыгнет!

    Вот так выглядит RBD (выделен салатовым) и RBM (жёлтым) у всех троих:


    Что тут интересного? Любопытно было видеть сайт EcoRI на 5’-крае RBM у всех троих (первый стык между салатовой и жёлтой областями) — весьма удобно. Интересно, насколько это распространённая фича у других штаммов? Беглый анализ показал, что наша троица — рекордсмены по количеству таких сайтов в геноме, у других летучемышиных штаммов их всего по 5:


    Возвращаясь к анализу RBD, из особенностей CoV2 можно отметить новые сайты рестриктаз, выделенные красными прямоугольниками — они совпадают с уникальными мутациями в аминокислотной последовательности (тоже отмечены красными прямоугольниками на аминокислотных сиквенсах в крайней правой колонке). На всякий случай я выделил ещё несколько новых сайтов: голубые прямоугольники и зелёный прямоугольник, который находится в районе единственной аминокислоты, различающейся между RBM CoV2 и панголина-19.

    Давайте ещё сравним у всех троих штаммов место врезки PRRA, создавшей в CoV2 фуриновый сайт:


    Тут тоже появилось несколько новых сайтов (выделены голубым) по обе стороны от новой вставки. Могли ли они быть использованы для создания фуринового сайта? Теоретически да. Но вставку можно было сделать и используя имеющиеся сайты, или даже создав сегменты с новыми сайтами, которые затем соединить «бесшовно», то есть не создавая новых сайтов на стыке. Если помните, Барик ещё в 2002 году применил эту технологию для создания синтетического клона мышиного коронавируса:

    Места соединения сайтов рестрикции, которые расположены на концах каждой кДНК, систематически удаляются во время сборки полного полноразмерного продукта кДНК, что позволяет проводить повторную сборку без внесения изменений нуклеотидов.

    Исходный текст

    А в 2003 повторил на синтетическом клоне SARS-CoV:

    Чтобы быстро собрать консенсусные клоны, мы использовали рестрикционные эндонуклеазы класса IIS, которые разрезают в асимметричных участках и оставляют асимметричные концы. Эти ферменты генерируют специфичные уникальные оверхенги, которые обеспечивают бесшовное лигирование двух кДНК с последующей потерей рестриктазного сайта.

    Исходный текст

    Сегодня технология жонглирования генными последовательностями уже настолько автоматизирована и поставлена на поток, что в китайской статье от октября 2019 года про врезку нового фуринового сайта в куриный коронавирус её описанию отведено лишь пару предложений:

    2.2. Создание рекомбинантного вируса
    Рекомбинантный вирус rYN-S2/RRKR, содержащий шиповидный белок с фуриновым сайтом S2', был получен путем vaccinia рекомбинации, как описано ранее [20, 28]. Вкратце, плазмиду с фуриновым сайтом S ‘генерировали с использованием набора для бесшовной сборки Seamless Assembly kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) и трансфицировали в клетки CV-1, инфицированные вирусом vaccinia, содержащим геном YN-?S-GPT. Сайт Furin-S2 был введен в кДНК YN путем гомологичной рекомбинации с использованием системы временной доминантной селекции [25].

    Исходный текст

    Невозможно не восхищаться тем, до чего дошел прогресс! Вот описание вышеупомянутого набора для бесшовной сборки Seamless Assembly kit:

    Набор для бесшовного клонирования и сборки GeneArt позволяет одновременно и направленно клонировать от 1 до 4 фрагментов ПЦР, состоящих из любой последовательности, в любой линеаризованный вектор с помощью одной 30-минутной реакции при комнатной температуре. Набор содержит всё необходимое для сборки фрагментов ДНК и их трансформации в E.coli для отбора и роста рекомбинантных векторов.
    • Скорость и простота — клонируйте до 4 фрагментов ДНК с выбранной последовательностью одновременно в одном векторе (до 13 Кб); не требуются сайты рестрикции, лигирования или рекомбинации
    • Точность и эффективность — предназначен для клонирования того, что вы хотите, где вы хотите, в нужной ориентации и достижения до 90% правильных клонов без лишних последовательностей.
    • Гибкость вектора — используйте наш линейный вектор или вектор по вашему выбору
    • Бесплатные инструменты — Создавайте ДНК-олиго и многое другое с помощью нашего бесплатного веб-интерфейса, который шаг за шагом проведет вас через ваш проект
    • Разнообразные приложения — Оптимизируйте многие методы синтетической биологии и молекулярной биологии с помощью быстрой комбинации, добавления, удаления или обмена сегментов ДНК.

    Исходный текст

    До 4-х фрагментов ДНК можно склеить в нужной последовательности за каких-то полчаса, причём без головной боли с рестриктазами или лигацией. И загрузить своё творение в E. coli для размножения полученной конструкции.

    Подводя черту под анализом рестриктазных сайтов, необходимо признать, что никаких однозначных выводов по его итогам сделать нельзя. Разве что в очередной раз можно было убедиться, что не только CoV2 уникален, но и сам RaTG13 очень необычный товарищ, и что стоит дальше изучать его биографию.

    Кодоновые предпочтения


    В этих целях я ещё решил взглянуть на codon usage bias, чтобы посмотреть на какие штаммы других вирусов похожи CoV2 и RaTG13. Не секрет, что вирусы склонны подстраиваться по своей кодоновой сигнатуре под предпочтения их хозяев, поэтому я ожидал увидеть у RaTG13 схожий паттерн с другими лечучемышиными вирусами, а также надеялся увидеть отличие от панголиньих штаммов.

    Вот SARS-CoV, например, очень похож на Rs3367 и RsSCH014, как и можно было ожидать:


    Между собой, кстати, SARS, MERS и CoV2 различаются:


    RaTG13 похож на CoV2, что тоже вполне ожидаемо:


    А вот на панголиньи штаммы RaTG13 действительно не супер похож, да и между собой панголиньи штаммы не то чтобы идентичны:


    На ZXC21 и ZC45 тоже не сильно похож:


    Из юньнаньских штаммов RaTG13 от Rs3367 и RsSCH014 довольно далёк, а ближе всего к LYRa11, но тоже с заметными различиями:


    В общем, как всегда, RaTG13 и CoV2 стоят как-то обособленно. Ещё меня заинтриговал AAA кодон — он у них используется намного чаще, чем у соплеменников:


    Вероятно, это просто очередное совпадение, но схожая пропорция между AAA и AAG наблюдается у E. coli. Может ли меняться кодоновая сигнатура у cDNA по мере её длительной культивации в клеточной культуре? В теории, да, но я пока глубоко эту тему не копал.

    Что ж, кодоновый анализ тоже не выявил каких-то явных признаков рукотворности, но в очередной раз подтвердил уникальность CoV2 и RaTG13. Что у нас есть в сухом отстатке? Пока что лишь некий набор странных совпадений, который, как любят выражаться учёные, taken together, то есть, в совокупности, заставляет очень сильно задуматься. И уж точно не позволяет отвергнуть гипотезу о рукотворной природе CoV2.

    А как же опровержение рукотворности в Nature?


    Как не позволяет? А почему авторам той статьи в Nature позволяет? На самом деле никакого опровержения рукотворности в той статье нет. Есть только громкое «нам так не кажется», базирующееся на весьма зыбком фундаменте. Сами посудите — вот основные тезисы авторов в поддержку нерукотворности:

    Хотя приведенный выше анализ предполагает, что SARS-CoV-2 может связываться с человеческим ACE2 с высокой аффинностью, вычислительный анализ предсказывает, что его взаимодействие не является идеальным, и что его последовательность RBD отличается от показанной оптимальной последовательности для SARS-CoV [первый SARS — Ю.Д.] для связывания с рецептором. Таким образом, высокоаффинное связывание шиповидного белка SARS-CoV-2 с человеческим ACE2, скорее всего, является результатом естественного отбора на человеческом или подобном человеку ACE2, который позволил возникнуть другому оптимальному решению для связывания. Это убедительное доказательство того, что SARS-CoV-2 не является продуктом целенаправленных манипуляций.

    Исходный текст

    Эта цитата в статье приведена прямо под диаграммой, на которой показаны идентичные RBM у CoV2 и панголина-19. Погодите, тогда при чём тут «компьютерное моделирование»? Наиболее вероятный сценарий рукотворности — перенос RBM из штамма одного животного в штамм другого — что вирусологи уже делали многократно. Поэтому логическая цепочка авторов не выдерживает никакой критики: «на компьютере можно было и круче вирус сдизайнить, значит CoV2 — результат естественного отбора. О, значит это и есть весомое доказательство того, что CoV2 нерукотворен!» Видимо, плохо с логикой у авторов. Дальнейшие их тезисы это подтверждают:

    Кроме того, если бы была проведена генетическая манипуляция, вероятно, была бы использована одна из нескольких обратных генетических систем, доступных для бета-коронавирусов. Тем не менее, генетические данные неопровержимо показывают, что SARS-CoV-2 не получен из какой-либо ранее использованной вирусной основы.

    Исходный текст

    Опять та же логическая ошибка, завуалированная громкими оборотами: «генетический анализ неопровержимо доказывает, что CoV2 абсолютно точно не был создан на основе ранее известных вирусов!» Ну спасибо, Капитан Очевидность. И что, неужели создатели вируса не могли сделать cDNA backbone из ранее не публиковавшегося штамма вируса — например, из того же RaTG13? Да легко. Также им не составило бы труда затем туда вставить панголиний RBM и фуриновый сайт. Вирусологи этим занимаются 20 лет, а современный инструментарий генной инженерии делает такие манипуляции доступными даже студенту.

    Насчёт возникновения фуринового сайта в клеточной культуре авторы тоже высказывают странные тезисы:

    Приобретение как фуринового сайта расщепления, так и предсказанных O-связанных гликанов также противоречит сценариям возникновения в клеточной культуре. Новые фуриновые сайты расщепления наблюдались только после длительного пассирования вируса птичьего гриппа с низкой патогенностью in vitro или in vivo. Кроме того, гипотетическая генерация SARS-CoV-2 в клеточной культуре или пассировании в животных потребовала бы предварительного выделения вируса-предшественника с очень высоким генетическим сходством, которое не было описано. Последующее образование фуринового сайта потребовало бы повторного пассирования в клеточной культуре или у животных с рецепторами ACE2, сходными с таковыми у людей, но такая работа также ранее не была описана.

    Исходный текст

    Во-первых, сами же авторы ранее приводят ссылки на работы, где фуриновый сайт возникал по мере культивирования вирусов в клетках. А во-вторых, что значит, не описан близкий штамм вируса — а как же RaTG13? Если в нём синтетически заменить RBM на панголиний, а затем культивировать химерный штамм в клеточной культуре, то фуриновый сайт вполне мог возникнуть и таким образом, и вдобавок, таким же путём новый штамм мог приобрести и другие мутации, отличающие CoV2 от RaTG13 и панголина-19.

    Но в плане именно рукотворного варианта возникновения фуринового сайта мне более вероятным видится вариант с целенаправленной врезкой — как в другой китайской работе от октября 2019 года с куриным коронавирусом. А уже затем созданный штамм мог приобрести новые мутации по мере его культивирования in vitro или in vivo — как мышиный штамм MA15 в 2007 году, например.

    Ши Чжэнли-2020


    Пока я писал эту статью, вышла работа большого коллектива китайских вирусологов, включая Ши Чжэнли, в которой они ещё в феврале протестировали против CoV2 свою многолетнюю разработку от многих видов коронавирусов — некий пептид, который призван блокировать слияние шиповидного белка с клеточной мембраной. Авторы, конечно же, упоминают новый фуриновый сайт CoV2, и предполагают, что он может играть важную роль в гораздо более эффективном проникновении CoV2 в клетку:

    В этом исследовании мы показали, что SARS-CoV-2 демонстрирует гораздо более высокую способность слияния с мембраной, чем SARS-CoV, что позволяет предположить, что механизм слияния SARS-CoV-2 является важной мишенью для разработки ингибиторов слияния коронавируса.

    Как правило, в β-В коронавирусах отсутствует фуриновый сайт S1/S2, а их шиповидные белки в нативном состоянии не расщеплены. Например, SARS-CoV проникает в клетку главным образом через эндосомальный путь слияния с мембраной, где его шиповидный белок расщепляется эндосомным катепсином L и активируется. Приобретение фуринового сайта S1/S2 может значительно увеличить способность шиповидного белка SARS-CoV проникать через клеточную мембрану.

    Исходный текст

    В этом контексте становится интересно, а не проводили ли авторы ранее какие-то эксперименты по тому, как на эффективность их пептида может влиять добавление новых фуриновых сайтов в различные коронавирусы? Но не будем строить лишние догадки, позволим времени расставить всё по своим местам.

    Кстати, Барик, видимо, решил не отставать от Ши Чжэнли, и тоже присоединился к гонке по поиску средств от CoV2. Как я понял, он и соавторы взяли уже имевшиеся у них данные об эффективности своего нуклеозидного аналога (β-D-N4-hydroxycytidine, NHC) против SARS-CoV и MERS, добавили in vitro данные по CoV2, и отправили в печать. Нуклеозидные аналоги (как, например, знаменитый ремдесивир) — это принципиально другой подход, чем у Ши Чжэнли и соавторов: тут авторы пытаются помешать репликации вируса, подсовывая ему «дефективные» буквы генетического алфавита, а Ши Чжэнли и соавторы пытаются не дать вирусу проникнуть в клетку. Теоретически, эти подходы можно будет комбинировать.

    This is the end, beautiful friend


    Ох, надеюсь до этого момента хоть кто-то дочитает. Простите, если утомил вас. Сам в шоке: кроличья нора оказалась целым подземным царством. Ещё надеюсь, что вам было интересно погрузиться в мир вирусологии и непредвзято рассмотреть гипотезу рукотворной природы CoV2. На мой взгляд, приведённый мной массив данных, в совокупности, не позволяет отвергнуть эту гипотезу.

    На всякий случаю, поясню: это НЕ означает, что CoV2 точно был синтезирован в лаборатории. Да, чисто технически, создать такой штамм современному вирусологу не составило бы труда. Но прямых доказательств тому, что кто-либо это сделал, нет. А странные совпадения пока не могут служить даже косвенными доказательствами.

    Но и обратная гипотеза об исключительно натуральной природе вируса тоже ещё вескими доказательствами не подкреплена. Пока не обнаружено промежуточных предков между RaTG13, панголином-19 и CoV2, в которых бы можно было проследить ту селективную рекомбинацию, которую мы наблюдаем у CoV2, вопрос о его происхождении остаётся открытым. Пожалуй, лучше самого Ральфа Барика на эту тему не выскажется никто:

    Какие животные являются зоонозными носителями SARS-CoV-2?
    Такие животные пока не найдены. Есть сведения, что панголины потенциально могут быть промежуточным хозяином, но вирусы панголина лишь на 88–98% идентичны SARS-CoV-2. Для сравнения, штаммы цивет и енотовидных коронавирусов первого SARS были на 99,8% идентичны штаммам SARS-CoV 2003 года. Другими словами, мы говорим о нескольких мутациях между штаммами цивет, енотовидных и людей в 2003 году. Панголиньи [штаммы CoV2] имеют более 3000 нуклеотидных изменений, поэтому панголины никоим образом не могут быть резервуарным видом. Абсолютно без шансов.

    Исходный текст

    Такие дела.

    ****************************************************************************

    UPD: о 4% разницы между геномами RaTG13 и Cov2


    Некоторые критики лабораторной гипотезы утверждают, что наблюдаемое ~ 4% генетическое различие между RaTG13 и CoV2 слишком велико, чтобы это могло произойти в лаборатории, если сам RaTG13 использовался в качестве основы. Наблюдаемые скорости мутаций для РНК-вирусов варьируются в широких пределах — от 10-6 до 10-4 нуклеотидов на репликацию in vitro, а у людей CoV2, по-видимому, мутирует со скоростью 25 мутаций в год. Таким образом, по логике критиков, потребовались бы годы, если не десятилетия, чтобы эти два штамма разошлись на 4%. Несмотря на то, что это резонное возражение, я вижу несколько проблем с ним.

    Во-первых, скорости мутаций in vitro намного выше чем in vivo, поскольку вы можете пассировать клетки гораздо чаще, чем заражать новых животных. Как показали эксперименты с SARS и MERS in vitro, существенные мутации могут наблюдаться уже после нескольких пассажей. Например, в статье 2004 года сообщалось, что после 600 пассажей уже наблюдалось 2,1% различий в геномных последовательностях шиповидный белков  между исходным штаммом и его потомством:



    Более того, в присутствии некоторых противовирусных препаратов, например, тех же нуклеозидных аналогов (рибавирина или ремдесивира), частота мутаций в РНК-вирусах может увеличиваться втрое:

    Мы получили оценку частоты спонтанных мутаций ок. 10-4 замены на сайт или ниже, что находится в пределах общепринятого диапазона для РНК-вирусов. Примерно трехкратное увеличение частоты мутаций и значительное смещение мутационного спектра наблюдались в образцах пациентов, получавших лечение интерфероном и рибавирином в течение 6 месяцев. Этот результат согласуется с известным мутагенным действием рибавирина in vitro и предполагает, что противовирусный эффект лечения рибавирином и интерфероном, по крайней мере, частично проявляется в результате летального мутагенеза.

    Исходный текст

    Таким образом, если лабораторный предок CoV2 тестировался для оценки того, как его мутагенез может менять эффективность потенциальных вакцин или противовирусных препаратов против него, он вполне мог достаточно быстро накопить существенные различия.

    Но, возможно, самая большая проблема с аргументом о 4% -ной разнице заключается в том, что он основан на том, что штамм RaTG13 является именно тем, чем его объявил WIV, и что других, более близких штаммов в их коллекции нет. Если мы хотим непредвзято рассмотреть гипотезу о лабораторной утечке, мы должны признать, что не можем полностью доверять данным от той самой лаборатории, которая подозревается в утечке. Если утечка все-таки произошла, как предполагает гипотеза, то WIV уже пытается ее скрыть, и предоставляемые ими данные вполне могут следовать той же цели.

    Ещё раз хочу подчеркнуть, что я не утверждаю со 100%-ой уверенностью, что именно это произошло. Всё, что я говорю, это то, что, несмотря на заявления некоторых уважаемых учёных об обратном, утечка всё же могла произойти, и нам нужно гораздо больше доказательств, прежде чем мы сможем прийти к окончательному выводу. Но — и это важный момент — даже если CoV2 действительно был случайной утечкой, сами ученые в этом не виноваты, так как они работали в рамках общепринятых международных законов, и ничего криминального в том, что они делали не было, и нет. У меня нет никакой антипатии к самим вирусологам, наоборот, я восхищаюсь тем, каких высот достигла фундаментальная биология и генная инженерия. А вот к тем, кто, если утечка произошла, пытается её скрыть, совсем другой разговор.

    Кстати, есть кое-что, что могло бы помочь поверить утверждениям WIV о природе RaTG13 – если они согласятся передать независимым лабораториям свои юньнаньские образцы от 2013 года, из которых Ши Чжэнли извлекла RaTG13. У них они всё ещё должны быть, если они в 2020 году повторно из них секвенировали полный геном RaTG13.

    ****************************************************************************

    UPD2: RaTG13 — тот же штамм, что и RaBtCoV/4991?


    После того, как я опубликовал этот пост, мне указали на препринт, в котором утверждается, что RaTG13 на самом деле может являться штаммом RaBtCoV/4991 (KP876546), об обнаружении которого в 2013 году в заброшенной Юньнаньской шахте группа Ши Чжэнли сообщала в 2016 году. Есть несколько причин так считать. Прежде всего, единственная опубликованная последовательность из RaBtCoV/4991 на 100% идентична последовательности RaTG13 на уровне нуклеотидов, хоть это всего лишь и 370 нуклеотидов из гена RdRp:


    Во-вторых, данные о сборе материала, из которых были выделены эти штаммы, практически идентичны: оба были собраны в июле 2013 года из мазка летучих мышей R. affinis:



    Образец с RaBtCoV/4991 был собран на шахте, расположенной в округе Мудзян, который находится под юрисдикцией города Пуэр:

    Автономный округ Мудзян является автономным округом под юрисдикцией города Пуэр, на юге провинции Юньнань, Китай. Wikipedia

    А город Пуэр указан как место сбора RaTG13 в базе данных GISAID, что вполне может быть приблизительным указанием местоположения шахты в Мудзян.

    Странно, что в своей статье от 2020 года о RaTG13 Ши Чжэнли не упоминает RaBtCoV/4991 и не цитирует свою статью 2016 года о его открытии, в которой она указана как «разработавшая и координировавшая исследование». При этом, вряд ли RaBtCoV/4991 был совсем забыт, так как он упоминается в статье группы Ши Чжэнли от 2019 года, где он включен в филогенетическое древо других коронавирусов:


    Я сомневаюсь, что место RaBtCoV/4991 в этом дереве было определено исключительно на основе фрагмента в 370 нуклеотидов, поэтому я думаю, что к началу 2019 года группа Ши Чжэнли уже секвенировала его геном.

    Кстати, интересно, что геномы панголина-2017 и панголина-2019 также очень близки к RaTG13 и CoV2 в этом участке гена RdRp, а CoV2 и панголин-2019 имеют несколько общих мутаций, не наблюдаемых в RaTG13:


    Я также решил сравнить кодоновый профиль между RaTG13 и другими штаммами из R. affinis, живших в той же заброшенной шахте. К сожалению, для других штаммов Ra были опубликованы только 816-нуклеотидные сегменты из гена RdRp (RaBtCoV/3750 и RaBtCoV/4307–2), поэтому для сравнения кодоновых предпочтений я извлек соответствующий 816-нуклеотидный сегмент из RaTG13. В итоге, RaTG13 опять заметно отличается, в то время как два других штамма довольно близки:

    Комментировать

    осталось 1185 символов
    пользователи оставили 2 комментария , вы можете свернуть их
    Екатерина Иванова # написала комментарий 23 января 2021, 12:40
    Короче - 30 лет под ложным предлогом борьбы с вирусами, которых нет, узаконено их создание. Сколько и каких этих вирусов состряпано покрыто тайной. Данные об исходнике уханьского тоже. Дана его формула и всё. При этом исходник лежит в лабораториях. Значит целенаправлено и давно создаются вирусы для пандемий. Их производство поставлено на поток. Сколько и каких нужно будет, столько и наклепают. При этом бесшовный метод сшивания не оставляет возможности определить искусственное происхождение этих вирусов.
    Их образцы хранятся в лабораториях. И никто ни разу не поставил цель уничтожить все эти лаборатории, найти заказчиков этого уничтожения человечества. По сути мировой вирусной войны. И тех, кто их заказы выполнял. То есть заказчиков и исполнителей. А поскольку производство этого вирусного оружия узаконено, то причастность властей стран, где оно создавалось, доказывать не нужно. Это очевидно.
    Пока заражают вирусами, у которых в процессе внедрения в клетки и лечения изменяются только шипы. Что будет дальше неизвестно. Это о вакцинации.
    Антивирусные препараты помимо опасных для жизни побочек, способствуют изменению вируса. Его эффективность заражения растёт.
    Екатерина Иванова # ответила на комментарий Екатерина Иванова 23 января 2021, 12:53
    Задействованы вирусологи и генетики США и КНР. Но возможно, что не только они. Лаборатории можно закрывать и открывать в разных точках планеты. Даже если сейчас начнётся охота, то они будут действовать из глубокого подполья. Возможно такие лаборатории уже есть. На случай таких ситуаций. Поэтому действовать нужно очень тонко и осторожно. Поэтому открыто об этом никто до сих пор не говорит. И это правильно. А все показушные шоу рупоров глобалистов направлены на устрашение. Смотрите, мы делаем с вами что хотим. И нам ничего за это не будет. Заодно таким образом они наблюдают за ответной реакцией. Это помогает им прогнозировать исход этой войны и вырабатывать новые методы атак на противника и прорыв его обороны, сохранять свои позиции и т.д.
    • Регистрация
    • Вход
    Ваш комментарий сохранен, но пока скрыт.
    Войдите или зарегистрируйтесь для того, чтобы Ваш комментарий стал видимым для всех.
    Код с картинки
    Я согласен
    Код с картинки
      Забыли пароль?
    ×

    Напоминание пароля

    Хотите зарегистрироваться?
    За сутки посетители оставили 790 записей в блогах и 6459 комментариев.
    Зарегистрировался 51 новый макспаркер. Теперь нас 5028862.